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美股期权交易基础

什么是期权市场的PCR指标?

PCR扩增仪

重复循环变性-退火-延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一轮循环需2~4分钟,如此反复进行,每一轮循环所产生的DNA均能成为下一轮循环的模板,每一轮循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增1倍,PCR产物以2的指数形式迅速扩增,经过25~30轮循环后(2~3小时),理论上可使基因扩增10 9 倍以上,实际上一般可达10 6 ~10 7 倍。

PCR扩增仪 PCR的反应动力学

PCR的三个反应步骤反复进行,使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA扩增量可用y=(1+X) n 计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数,X表示平均每次的扩增效率,n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%,实际反应初期,靶序列DNA片段的增加呈指数形式,随着PCR产物的逐渐积累,被扩增的DNA片段不再呈指数增加,而进入线性增长期或静止期,即出现“停滞效应”,使平均效率达不到理论值 [2] 。

免疫 PCR 检测

我们的寡核苷酸偶联试剂盒使用简单,而且能够快速高效地生成稳定的抗体-寡核苷酸偶联物。将寡核苷酸加入寡核苷酸活化试剂瓶中,另将抗体加入抗体活化试剂瓶中,然后在室温下将两个小瓶孵育 30 分钟。孵育期间,洗涤两个脱盐柱。活化后,将寡核苷酸混合物通过其中一根脱盐柱,抗体混合物通过另一根脱盐柱。然后,在室温下一起孵育抗体和寡核苷酸 1 个小时,即可使用偶联物。可在这一步根据需要增加清理步骤,以去除未结合的寡核苷酸。

3.使用寡核苷酸偶联试剂盒 (ab218260) 生成的免疫 PCR 数据。从 HyTest 采购的非偶联的人 CRP 特异性小鼠单抗(克隆 C7)。用寡核苷酸偶联试剂盒将抗体和寡核苷酸进行偶联,将抗体用作夹心免疫 PCR 检测中的检测抗体,并选用一种 CRP 多克隆抗体作为捕获试剂。

上图(图 3)绘制了 PCR 循环次数与含 PCR 探针的 SYBR Green 在特定抗原浓度下产生的荧光强度的关系。下图(图 3)显示了抗原用量与循环次数之间的关系数据,便于计算标准曲线。结果表明,检测使用的捕获抗体和检测抗体分别比等效的 ELISA 少 1000 倍和 100 倍,但灵敏度却提高了 1000 倍。

师姐呕心沥血整理的 qRT-PCR 注意事项

但是实验室一般不会有 Agilent 2100 Bioanalyzer,在这种情况下,我们可以通过甲醛胶检测,但是对 RNA 总量的要求高,那么最快速的方法就是用普通的凝胶电泳。要求在 nuclease-free 的环境下,所以需要将电泳槽、溶胶瓶、凝胶托槽以及梳子用 DEPC 水冲洗干净。琼脂糖也是 nuclease-free(只要是新开封的就行),Loading Buffer 尽可能是新开封的,配置 1.2% 的凝胶。

注意,凝胶一定要保证溶解完全,要不然会导致条带不均一,如图中样品 9。电压太高或者跑太长时间会产热,导致 RNA 降解,所以要合理控制电压和时间。此外,跑胶也可以进一步确定样品中是否有 DNA 的残留,观测点胶孔是否有大量滞留的条带。

你确定你的 cDNA 的浓度吗?

实验室大师兄的经验是每次反转得到的 20 ul 体系的 cDNA 直接稀释 20X,而博后师姐是按照 10X 稀释,我一般是看情况而定。因为每个人提的 RNA 质量不同,反转的水平也分高低,再说反转的技术也未必稳定。

所以在每次拿到反转的 cDNA 后,我首先会稀释 3 倍左右,然后利用管家基因做一次 RT-PCR,循环数一般为 25 cycle,鉴定一下具体浓度,再决定最后的稀释倍数。

你确定你的引物好用吗?

可以通过 qRT-PCR 的溶解曲线,但是呢,这个还是要耗钱的。对于没有很多钱的实验室来说,在拿到很多引物的时候,可以通过普通的 RT-PCR 看看是否是单一条带,鉴定一下引物的特异性。如果实验室不差钱,则可以通过溶解曲线对所有的引物的特异性做一次鉴定。

你确定你的 PCR 板和仪器配套吗?

如果你用的是 BIO-RAD 公司的定量 PCR 仪器,那么你一定要买配套该仪器的 qRT-PCR 板。因为不兼容的 PCR 板会导致结果偏差。因为我的师姐就真的碰到过这种情况。

你确定你的实验条件合适吗?

SYBR 要避免强光照射,所以在加 SYBR 试剂的时候尽量关掉头顶的照明灯,只需借助微光完成就可以。

SYBR 放置 4 ℃ 保存,使用时轻轻上下颠倒混匀即可,避免泡沫产生,切忌用力涡旋。

有些小师妹怕自己加样搞混,喜欢在 PCR 板上划出标志,这样做是不对的。因为你的标记极有可能影响到荧光信号的采集,所以一般我会建议师妹采用实验记录本协助记忆,如下所示。

你确定你的操作正确吗?

为了减少 SYBR 在光下的曝光,个人喜欢先加入模板, 如下图。根据经验,少量模板的加入,容易造成加样误差。所以为了尽量减少加入少量模板造成的误差,我一般会将样本再稀释一倍,加样的时候多加一倍,减少 H 2 O 2 的加入量。

然后配置 qRT-PCR 体系,如下。

加好样品后,贴好透明封板膜。尽量不要用手碰透明封板膜的表面,从膜两边空余处操作就行。因为手印也有可能可能影响到荧光信号的采集。然后就是用离心机低速迅速离心 10 S,防止样本挂壁。

好了,基本的操作部分以及注意事项就这么多,希望能帮到大家。想看更多,点击阅读原文,有 PCR 合集 操作视频,包括普通 PCR、RT-PCR、qPCR等。

刘晓晴教授:MPR在肺癌新辅助临床研究中的价值

MPR的定义是新辅助治疗诱导的肿瘤消退在病理上残留肿瘤60%的患者存活更长( 61月 vs. 22月, p=0.03)。Pataer等进行了是否行新辅助化疗的NSCLC患者的组织病理学缓解与生存之间的关系研究,研究结果于2012年发表于《胸部肿瘤学杂志》(J Thorac Oncol),结果显示,病理分期为0、1A和IB期的患者OS和DFS明显长于II期、IIIA期;不同肿瘤细胞残存比例与生存相关(P=0.003); MPR<10%组 什么是期权市场的PCR指标? OS、DFS优于MPR>10%组(5年OS,85%对比40%,P<0.0001;5年DFS, 78% 对比35%,P<0.001);控制病理分期下,MPR仍与生存( OS、DFS )相关。MDACC的一项回顾性研究对160例接受新辅助化疗(89%紫杉醇或多西紫杉醇+铂类)的患者进行分析显示,病理学缓解(≤10%对比>10%活肿瘤,P=0.002)相比临床RECIST缓解(P=0.03)对OS的预测效果更强。鉴于此,专家(Hellmann, et al. Lancet Oncol, 2014)认为,病理学缓解可以反映疗效,且缓解程度与OS有关。但由于pCR比例较少,限制了其作为替代终点的应用,所以病理学显著缓解MPR(新辅助治疗后残余活肿瘤≤10)可作为新辅助治疗替代终点。

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MPR在免疫治疗时代的价值和应用

2018年《肿瘤学年鉴》(Annals of Oncology)发表了约翰霍普金斯癌症中心(SKCCC)和纪念斯隆-凯特林癌症中心(MSKCC)20例NSCLC患者接受纳武利尤单抗新辅助治疗(II期临床研究:NCT02259621)后获得完全肿瘤切除和胸部淋巴结切除标本的组织病理学反应特征和免疫介导的肿瘤清除特征的结果。研究中只有10%(2/20)的患者在手术切除时有放射学客观反应,45%(9/20)的切除肿瘤显示出MPR。通过放射学和病理学相关性鉴定肿瘤组织,尝试建立了一种新的定量免疫相关病理缓解标准,一种新的评分系统irPRC( 免疫相关的病理反应标准),以期用于抗PD-1/PD-L抑制剂进行新辅助治疗NSCLC术后病理评估。与接受化疗后的肿瘤组织病理评价不同,免疫治疗对肿瘤退缩床的病理特征评估涵盖了增殖/新的纤维化、新生血管、弥漫肿瘤浸润淋巴细胞等。新的病理缓解标准在肿瘤缓解床等基础上增加残留活性肿瘤和坏死。此外,增加“间质”、“纤维化”和“炎症”等特异性描述肿瘤浸润淋巴细胞和再生淋巴管结构。结论认为,irPRC可被用于免疫治疗疗效的标准化病理评估,但需要长期随访以确定irPRC作为无复发生存(RFS)和OS替代指标的可靠性。

LCMC3是一项单臂、开放、多中心Ⅱ期研究,旨在评估阿特朱单抗用于ⅠB-ⅢA期NSCLC患者新辅助治疗的疗效与安全性。第一部分评估阿特朱单抗1200 mg每3周两次静脉注射后的MPR;第二部分则是探索性研究,观察12个月的阿特朱单抗辅助治疗效果。另一项新辅助免疫治疗研究NEOSTAR是纳武利尤单抗或纳武利尤单抗联合伊匹木单抗治疗既往未接受过治疗、适合手术切除的I-IIIA期NSCLC的II期研究,主要终点≤10% 存活肿瘤MPR。两项研究的影像学(RECIST)ORR:7%~22%;病理:MPR率:18%~33%,虽然有影像与病理反应不符合的情况,但总体肿瘤直径变化与病理退缩有较好的相关性,且免疫治疗毒性相对低(≥3级:6-11%),进展率低(≤5%),手术切除率高(~90%)。尽管研究纳入患者例数少,但也说明新辅助免疫治疗的必要研究价值和意义。目前正在进行的多数新辅助免疫治疗研究CheckMate 816、KEYNOTE-617、IMpower030、AEGEAN,等主要研究终点均包含了MPR,预期这些研究结果将进一步证实MPR在新辅助治疗中作为生存替代终点的价值。

小结

简言之,目前学术界认为MPR可以作为新辅助研究的主要研究终点,潜在加速了药物审批,但是仍然存在争议并面临挑战:1. 影像 RECIST评价与组织病理学反应有差异,如何权衡和统一;2. NSCLC新辅助化疗后MPR腺癌对比鳞癌存在差异,病理反应的最佳临界值是否需要细化;3. 新辅助免疫治疗有别于其他治疗,免疫治疗病理学改变多样,MPR测量、评价复杂繁琐,质量和推广是问题;4. MPR还需要更多前瞻性研究来证实其有效性及与DFS和OS的相关性。